PROTAC聯合CRISPR篩選 在這一抗癌領域大有可為

以PROTAC為代表的靶向蛋白降解療法是新藥開發的熱門領域之一。據不完全統計，今年已經有24款靶向蛋白降解療法進入臨床開發階段。近日，英國鄧迪大學（University of Dundee）的Alessio Ciulli教授團隊發表一篇綜述，盤點了使用PROTAC療法，靶向表觀遺傳學靶點的現狀，并對未來進行了展望。作者表示，CRISPR篩選與PROTAC技術的結合，為開發靶向表觀遺傳學靶點的蛋白降解療法提供了有力的工具。Ciulli教授也是初創公司Amphista Therapeutics的科學創始人，它在去年完成5300萬美元的B輪融資，致力于開發下一代靶向蛋白降解平臺。

表觀遺傳學在疾病病理中的作用

表觀遺傳學過程包括對DNA、DNA相關蛋白，以及RNA的修飾，這些修飾不改變基因序列，但是影響基因的表達。比如，對DNA的甲基化與基因沉默相關，很多對組蛋白的修飾在轉錄調節、DNA復制和修復、RNA剪接和染色體凝聚過程中發揮重要作用。

表觀遺傳學在疾病病理方面的作用也早已被確立，比如組蛋白脫乙酰酶（HDACs）在癌癥中高度表達。表觀遺傳學蛋白的功能缺失性或獲得性突變也經常驅動疾病病理學。歷史上，針對表觀遺傳學的抑制劑開發也獲得過成功，目前已經有7款靶向表觀遺傳學蛋白的抑制劑獲得美國FDA的批準上市。最近獲批的一款新藥為首款靶向組蛋白賴氨酸甲基轉移酶EZH2的抑制劑tazemetostat。

▲獲得FDA批準靶向表觀遺傳學蛋白的抑制劑（圖片來源：參考資料[1]）

然而，開發靶向表觀遺傳蛋白的抑制劑面對多重挑戰，主要限制之一是許多表觀遺傳蛋白家族的催化蛋白域或蛋白-蛋白互作域的結構高度保守，這讓開發靶向特定亞型的抑制劑變得非常困難，一個典型例子是BET蛋白。限制抑制劑應用的另一個局限是表觀遺傳學蛋白通常包含多個蛋白域，并且經常是由多個亞基構成的蛋白復合體的一部分。這些特征意味著使用抑制劑來阻斷單一催化活性或者一種相互作用，并不足以改變復合體的功能結果，因為還有許多其它活性或相互作用不受抑制劑的干擾。

▲開發小分子抑制劑調節表觀遺傳學過程面對的挑戰（圖片來源：參考資料[1]）

遺傳學篩選帶來的突破

基于RNA干擾（RNAi）和CRISPR基因編輯技術的遺傳學篩選為表觀遺傳學的靶點發現帶來了革命性的變化，這些技術讓科學家們可以系統性地敲低或者敲除基因組中單個基因的表達，從而發現表觀遺傳學蛋白缺失的作用，以及確立哪些疾病對表觀遺傳學蛋白的丟失尤其敏感。比如，使用RNAi篩選發現了急性髓系白血病細胞對BET蛋白Brd4活性的關鍵依賴性。而新近的CRISPR篩選與RNAi相比，可能提供更低的脫靶效應和更廣泛的應用范圍。而且，CRISPR篩選可以被設計成靶向特定基因亞群，比如表觀遺傳學因子。

不過，雖然CRISPR和RNAi篩選可以發現和驗證值得關注的靶點，但是針對這些靶點的抑制劑往往不能復制靶點敲除的表型。因為抑制靶點蛋白活性和敲除靶點蛋白表達具有不同的作用機制。這給靶向蛋白降解療法帶來了機會。

靶向蛋白降解療法是靶向表觀遺傳學靶點的重要工具

PROTAC蛋白降解療法利用細胞的泛素-蛋白酶體系統特異性降解靶點蛋白。這類分子通過將靶點蛋白與E3連接酶拉近并形成三元復合體，導致靶點蛋白的泛素化，隨后被蛋白酶體識別并降解。過去的研究顯示，PROTAC介導的蛋白降解能夠復制多個通過遺傳學敲除或敲低篩選發現的表觀遺傳學靶點的表型，而抑制劑往往無法做到。

表觀遺傳學蛋白往往構成多亞基的復合體，借此對基因組進行特定修飾。在靶向表觀遺傳學靶點方面，靶向蛋白降解是一種有力的策略，因為針對包含多蛋白域的蛋白，它可以靶向最容易添加泛素的蛋白域，即便這個蛋白域沒有活性功能，也可以導致整個蛋白降解。而在靶向多亞基蛋白復合體方面，它可以用于靶向最容易被降解的亞基，而這一亞基的清除可能造成整個復合體的不穩定和降解，靶向蛋白降解劑也可能介導E3連接酶在復合體中的非靶點蛋白上添加泛素鏈，導致整個復合體的降解。

▲PROTAC介導多亞基復合體降解的方式（圖片來源：參考資料[1]）

靶向表觀遺傳學復合體的PROTAC分子

作者在綜述中描述了多款靶向不同表觀遺傳學復合體的PROTAC分子。名為SWI/SNF的染色質重塑復合體在腫瘤和神經疾病中經常出現突變。針對這一復合體不同亞基，科學家們已經開發出一系列PROTAC分子。其中包括選擇性降解BRD9和BRD7的降解劑VZ185，它的發現證明通過不斷監測降解劑的細胞降解能力、三元結構的熱動力學等特征，系統性的降解劑迭代設計可以開發出高效蛋白降解分子，即使起始分子的降解特征不佳。

開發靶向SMARCA2/4亞基降解劑的研究證明在降解SMARCA2/4的同時，SWI/SNF復合體的其它亞基也同時得到清除。這些研究強調了選擇最容易被降解的亞基進行靶向，從而導致整個復合體降解這一開發策略的可行性。

▲靶向SWI/SNF的多種PROTAC分子（圖片來源：參考資料[1]）

PRC2復合體是一款組蛋白甲基轉移酶，它催化H3K27的甲基化，PRC2復合體近年來受到關注是因為科學家們發現，它的EZH2亞基與癌癥進展相關。FDA批準的EZH2抑制劑tazemetostat為靶向EZH2治療癌癥做出了臨床驗證。

PRC2復合體由4個關鍵亞基構成，SUZ12，RbAp46，EZH1/2和EED。多款針對這一復合體的蛋白降解劑已經被開發出來，它們都表現出選擇性調節特定亞基表達，或者導致所有PRC2亞基降解的能力。其中，靶向EZH2的PROTAC分子E7在實驗中不但提高了EZH2的泛素化水平，而且也提高了EED和SUZ12亞基的泛素化水平。這一結果顯示，PROTAC分子可以導致復合體中未被靶向的亞基的泛素化，從而引起整個復合體的降解。

PRMT5是一類精氨酸甲基轉移酶，在哺乳動物中負責組蛋白底物的甲基化。PRMT5表達的失控與多種預后不良的癌癥類型相關，包括肺癌、乳腺癌和肝細胞癌。使用組織特異性敲低實驗已經證明了這些癌癥類型對PRMT5的依賴性。目前，針對PRMT5的多款小分子抑制劑已經進入臨床試驗階段，包括葛蘭素史克、楊森和安進的在研療法。不過，目前的PRMT5抑制劑雖然可以抑制PRMT5的甲基轉移酶活性，但是尚沒有證據表明它們可以抑制PRMT5的骨架蛋白功能。PROTAC分子可能同時降低PRMT5的骨架蛋白功能，更有效地阻斷PRMT5的致癌作用。

▲靶向其它表觀遺傳學復合體的蛋白降解分子（圖片來源：參考資料[1]）

總結與未來展望

綜述作者指出，表觀遺傳學失調和疾病病理發生之間的聯系已經得到證實，特別是對預后不良的癌癥類型。近年來的遺傳學篩選發現了不少特定癌癥類型對表觀遺傳學調節因子的丟失尤其敏感，然而靶向這些靶點的抑制劑卻通常不能復制敲除或敲低蛋白的表型。PROTAC技術通過降解靶點蛋白，能夠更好地復制CRISPR或RNAi篩選發現的靶點表型。

靶向復合體中的一個亞基造成復合體其它亞基的降解是一個常見的現象。而且，PROTAC分子可以表現出比根據二元結合預期更高的靶向降解選擇性，這意味著降解劑可能比抑制劑的選擇性更高，從而擴展治療窗口，提高藥物的安全性。

展望未來，作者表示目前研究中發現的PROTAC分子尚未經過廣泛的藥物化學優化。在PROTAC的生物學機制和靶向表觀遺傳學靶點的優勢已經確認的情況下，作者認為，啟動更為廣泛的藥物化學工作，將是將這一治療模式轉化為臨床候選療法的下一步。

目前，靶向表觀遺傳學靶點Brd9的PROTAC降解劑CFT8634（C4 Therapeutics）和FHD-609（Foghorn Therapeutics）即將或已經步入臨床。作者表示，未來幾年里，無疑將有更多PROTAC降解劑靶向更多的表觀遺傳學靶點。

參考資料：

[1] webb et al., (2022). Targeting epigenetic modulators using PROTAC degraders: Current status

and future perspective. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, DOI: 10.1016/j.bmcl.2022.128653

▽關注【藥明康德】微信公眾號